人口老龄化 -> Neurodegenerative(神经退化)疾病流行度和发病率上升。

BBB限制了药物到达中枢神经系统 -> 目前治疗手段功效差 -> 需要 Novel Drug Delivery Systems(新型给药系统, NNDS)。

提出了 Polymeric nanoparticles(聚合纳米微粒) 方案。

选择：poly-(lactic-co-glycolic acid) (PLGA, 聚乳酸-羟基乙酸共聚物)

原因：

• biocompatibility(生物适应性)
• biodegradability(生物可降解性)

目标结构：PLGA loperamide-loaded nanoparticle

制备方法：

1. 使用 PIC 方法制备 nano-emulsion templating(纳米乳液模板)。
2. 药物溶液 + 纳米乳液模板 --蒸掉溶剂--> 产物

优点：精确尺寸控制，条件温和。

实验方法：hot-plate test(热板实验)

结论：证明了目标结构的表面被活性靶向部位(铁蛋白受体的单克隆抗体)活化时，能高速透过BBB。

Neurodegenerative(神经退化):

is the umbrella term for the progressive(逐步) loss of structure or function of neurons(神经元), including death of neurons. https://en.wikipedia.org/wiki/Neurodegeneration

loperamide(洛哌丁胺):

is a medication used to decrease the frequency of diarrhea(腹泻).

Mechanism: Loperamide is an opioid-receptor(阿片受体) agonist and acts on the μ-opioid receptors in the myenteric plexus of the large intestine(大肠肌间神经丛); by itself it does not affect the central nervous system. https://en.wikipedia.org/wiki/Loperamide

haloperidol(氟哌啶醇):

is a typical antipsychotic(抗精神病) medication. It is used in the treatment of schizophrenia(精神分裂症)... https://en.wikipedia.org/wiki/Haloperidol

the Phase Inversion Composition(PIC):

Phase inversion is a chemical phenomenon exploited(被利用在) in the fabrication(制造) of artificial(人工) membranes(膜). It is performed by removing the solvent from a liquid-polymer solution, leaving a porous(多孔), solid membrane. https://en.wikipedia.org/wiki/Phase_inversion_(chemistry)

Hot Plate Test(热板实验):

is a test of the pain response in animals, similar to the tail flick test. It is used in basic pain research and in testing the effectiveness of analgesics(止痛剂) by observing the reaction to pain caused by heat. https://en.wikipedia.org/wiki/Hot_plate_test

可以保证生物适应性，具有较长的血液循环时间和 targeting the brain capillary endothelial cells (BCEC, 脑毛细管上皮细胞靶向)，可以产生药理作用和减少副作用。

的制备过程会直接影响其穿透BBB的效率，安全性，生物代谢以及后面生产 Nanocarriers 的可用性。

因此，选择了 nano-emulsion templating 来制备 Polymeric Nanoparticle。

直径在 20-200 nm 范围内的液滴形成的乳液。

制备方法：

PIC, 室温。

原理：

表面活性剂曲率的自发变化 -> 发生乳化作用 -> 形成乳滴。

1. 乳滴 -> 分散相中原位单体聚合
2. 乳滴 -> 使用预制备的聚合物(溶解于挥发性有机溶剂)作为分散相。。。

2优于1的原因：避免了副产物，提高了生物适应性，减少了纯化步骤。

预制备的聚合物 中选用了 PLGA，原因：

1. 生物适应性和生物可降解性，确保安全治疗

证明使用PIC方法制备的纳米乳液模板是合适的，简单的技术，且可以使纳米微粒透过BBB进入 central nervous system(CNS, 中枢神经系统)。

• 为何选择洛哌丁胺？

作为一个**没有阵痛效果(无法进入CNS)**的药物模型。用聚合纳米微粒搭载洛哌丁胺研究BBB透过性有很广泛的应用。

搭载有洛哌丁胺的纳米微粒对铁传递蛋白受体的单克隆抗体(8D3)有作用。

补充：

8D3抗体是一种针对老鼠的，对抗铁传递蛋白受体(也称：转铁蛋白受体TfR)在BBB中的过度表达的单克隆抗体。它被用于动物体外实验。因此经过8D3抗体修饰过的纳米微粒会靶向作用于对应的受体上。

关于TfR：http://www.docin.com/p-41858747.html

• PLGA (Boehringer Ingelheim) / 羟基乙酸 = 75/25
• 乙酸乙酯, 乙醇 (Merck) 用作挥发性有机溶剂
• 聚山梨醇（吐温）80 (Croda), 表面活性剂
• 盐酸洛哌丁胺 (Sigma-Aldrich)
• 鼠铁传递蛋白受体(8D3)的单克隆抗体(Bionova)
• N-(3-dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC) (Fluka)
• N-hydroxisuccinimide sodium salt (NHS) (Sigma-Aldrich)
• NaCl, Na2HPO4·H2O, NaH2PO4·H2O (Merck)
• Water (微滤)
• CD1雄鼠，体重 30-35g，原文有误 (Harlan)

25°C，将 phosphate buffer saline(PBS, 磷酸缓冲盐溶液)，逐步加入到吐温80和(乙醇:乙酸乙酯 = 20/80)的混合物中，包含4%(质量百分数)的PLGA以及0.1%的LOP(洛哌丁胺)。

是否制备成功？

• 看：在水，表面活性剂，油相示意图中可以看到透明，半透明或轻微不透明的，显露出蓝色或红色的地方被认为是纳米乳液。
• 进一步确认：使用动态光散射描绘出粒子的尺寸。

使用 Buchi R-215V Rotavapor 设备在减压条件下，将溶剂蒸干得到纳米微粒分散态。

25°C，将4g纳米乳液的蒸干的条件是：45mbars的真空环境，150rpm的转速，45min。蒸发完成后，产物用微滤水调整为等渗溶液(300 mOsm/kg)。

在体内和体外的研究过程中，纳米微粒被浓缩以达到具有治疗作用的LOP浓度。浓缩过程使用 Centriprep® YM-3, 3 kDa 离心过滤器完成。

浓缩完成后，需要进行24h的透析来达到生理学的pH和等渗值(pH = 7.4 and osmolality = 300 mOsm/kg)。

约定：NP(0,8D3)表示未搭载药物的纳米微粒与8D3抗体的结合物。NE则表示纳米乳液。

液滴大小及其分布通过 dynamic light scattering(DLS, 动态光源散射) 确定。

仪器和条件：

• 分光计(LS Instruments, 3D 正交多重散射)
• 温度：25°C
• 632.8 nm He-Ne 光源
• 散射角为90°

ζ值由 Electrophoretic 的流动性测量设备和 Zetasizer NanoZS instrument (Malvern Co. Ltd., UK)，条件：

• 633nm He-Ne 光源

应用 Huckel-Onsager 方程计算得到：

• εr 表示水的相对介电常数
• ε0 表示真空介电常数
• η 表示液体黏度

由于这个公式只适用于低流动性液体，因此样本用蒸馏水以1:20稀释。

所设计的纳米乳液和纳米微粒的稳定性，在25°C由肉眼观察到的宏观改变来评估。

HPLC：

• Breeze HPLC (Waters Corporation, Milford, MA, USA)
• UV检测器，220nm(LOP具有最大吸收)
• 流动相：1.824mM，磷酸:乙腈 = 1:1，pH = 3.5，30°C
• 流速：1 mL/min
• 进样：50μL
• 分析50min

LOP的保留时间大约是42min。

通过离心分离器(Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit with Ultracell-3 Membrane, Millipore, Billerica, Massachusetts, USA)，离心已载药的纳米微粒达到3000Da，然后用HPLC(同型号和条件)分析游离出来的药物。

离心条件：

• 2300g
• 75min
• 25°C

药物诱导效率和载药率根据两个公式计算：

Entrapment efficiency (wt./wt.%) = (initial drug amount − free drug) / initial drug amount * 100 = (起始药物质量分数 − 剩余药物质量分数) / 起始药物质量分数 * 100

Drug loading (g/g) = amount of drug in nanoparticles / g of PLGA = 在纳米微粒上的药物质量 / PLGA的质量

透析袋，通过 Thermojacketted glasses 保温在25°C。袋内装满受体溶液50mL。

Molecular Weight Cut off(MWCO, 截流分子量)在3.5-5 KDa的膜，2mL样品并用受体溶液润湿。

每间隔一定的时间就取出1mL受体溶液，用HPLC分析其中LOP的浓度。

纳米微粒表面由于，8D3抗体上的氨基与PLGA聚合物上的羧基的共价结合，而被活化。

补充，碳亚二胺反应：

https://en.wikipedia.org/wiki/Carbodiimide

实验操作：

1. 用HCl酸化4g纳米微粒分散体(pH = 4.5-6)，加入过量的EDC和NHS，在25 °C下搅拌2h。
2. 取150 μL已活化的纳米微粒分散体，用NaOH调整pH=8。
3. 再取150 μL 8D3抗体(浓度：1 mg/mL, 0.5 mg/mL 或 0.25 mg/mL根据样品而定)加入到上面的溶液中。
4. 25 °C下搅拌培养混合物18h。

鉴定抗体是否成功与纳米微粒表面共价结合？

通过 size exclusion chromatography(SEC, 分子排阻色谱)，HPLC测定。

补充：

Size-exclusion chromatography

Size-exclusion chromatography (SEC) is a chromatographic method in which molecules in solution are separated by their size. https://en.wikipedia.org/wiki/Size-exclusion_chromatography

方法：MTT检验

The MTT assay is a colorimetric(比色) assay for assessing cell metabolic activity(代谢活动). NAD(P)H-dependent cellular oxidoreductase enzymes may, under defined conditions, reflect the number of viable cells present. https://en.wikipedia.org/wiki/MTT_assay

操作：

• 将HeLa细胞接种到96个槽中，每个槽大约6x10^3个细胞和200 μL DMEM培养基。
• 在37 °C下培养24h。
• 将培养基替换为制备的合适浓度的样品。
• 在37 °C，5% CO2气氛下培养24h。
• 加入 0.5 mg/mL (25 μL) MTT试剂，和PBS磷酸缓冲液。
• 再37 °C培养2h。
• 加入DMSO 200 μL 溶解沉淀物。
• 室温下震荡15min。

用分光光度计(SpectraMax M5) 在 570nm 处测定吸收值。

补充：

Hela

https://en.wikipedia.org/wiki/HeLa

将老鼠分为4组，保持水和食物供应，适应环境1周。动物实验原则参考：

Animal Ethics Committee of the University of Barcelona，标准为86/609/EEC。

旨在最小化动物的痛苦和减少动物用量。

饲养条件：

• 22 ± 1 °C，12-h 昼夜循环
• 自由觅食(standard laboratory diet, PANLAB SL, Barcelona, Spain)，饮水。

实验使用成年雄鼠(22-30g)，于尾静脉血管注射 5ml/kg 计量的吗啡(Spanish National Health Service 提供)。

痛觉通过热板分析仪 LE 7406 (PANLAB, SL, Barcelona, Spain)测试，小鼠被放置于设备中，设备通过温度调节器控制水浴温度在 54 ± 0.5 °C。

潜伏期的定义：从放置小鼠于热板到小鼠作出疼痛反应(舔前腿，跳出热板)的时间间隔。

每只老鼠做两次试验，分别测试出给药前的潜伏期和给药20min后的潜伏期。

经过预选，给药前的潜伏期超过10s的小鼠(约10%)被排除。热板测试截止时间为25s，超过25s没做出反馈的小鼠按25s计算。

给药计量： 3mg/kg；给药方式：尾静脉注射。

吗啡和洛哌丁胺对阿片μ受体的作用非常相似，pKi (morphine) = 9.28; pKi (loperamide) = 9.00

剂型：

1. 0.16 M PBS 溶液
2. 0.7 mg/ml (3 mg/kg) 吗啡水溶液
3. NP(0)
4. NP(0,8D3)
5. NP(0.1)
6. NP(0.1,8D3)
7. 0.7 mg/ml (3 mg/kg)洛哌丁胺水溶液(含15%吐温80)
8. 15%吐温80水溶液

使用SPSS Statistics 17.0软件进行结果的统计分析。

用T检验比较每组给药前和给药后的潜伏期的均值。

maximal possible effect (MPE) 由下式计算：

Paired-Sample T Test

Paired samples t-tests typically consist of a sample of matched pairs of similar units, or one group of units that has been tested twice. https://en.wikipedia.org/wiki/Student%27s_t-test

模型系统：

包装效率

由分离/离心法评价的洛哌丁胺的包装效率(EE)高于99%。

相当于载药浓度9 mg/g，25 mg/g PLGA的纳米微粒分散体系。

使用低浓度的洛哌丁胺可达到体外治疗作用。

先前准备的纳米微粒可通过连续离心的方法浓缩来达到洛哌丁胺的治疗剂量(1.5-7 mg/kg)。

经过10次浓缩过程可讲洛哌丁胺浓缩到0.7 mg/mL(相当于给药300 μL, 剂量是7 mg/kg)。

分散体系的pH值由于PBS的缓冲效应，在浓缩时不会被改变，但注意等渗值会变大。因此浓缩后有必要进行8h的透析过程来调整等渗值，使其达到生理值(300 mOsm/kg)。

上述过程完成之后，ζ 电势和纳米微粒的大小和先前准备的纳米微粒参数很相似。

体外释放

下面将对比：洛哌丁胺从 纳米微粒分散体，胶束溶液以及水溶液中的释放作用。

其中胶束溶液是15%吐温80水溶液。选择这种高浓度的表面活性剂的原因是为了：

• 能溶解治疗量浓度的LOP
• 进行体内试验的需要

上图显示，LOP在水溶液中5天完全释放。而胶束中的LOP释放了75%，纳米粒中的LOP只释放了15%。

NP(0.1)被8D3单克隆抗体修饰来拮抗铁传递蛋白受体在BBB中过度表达，利用聚合物上的羧基和利用碳亚二胺反应在抗体上形成的氨基。

上表显示：经过抗体修饰过的纳米微粒和没修饰过的纳米微粒的物化性质变化不大。

为确认8D3抗体是否和纳米微粒共价结合，采用SEC分析下面四种样品：

1. 8D3抗体
2. NP(0)
3. NP(0,8D3)
4. NP(0) + 8D3 (简单混合)

在HeLa细胞培养基上利用MTT法检验纳米微粒的细胞毒性。

3 mg/mL，30 mg/mL的：

1. NP(0.1)
2. NP(0,8D3)
3. NP(0.1,8D3) N/P = 12.5/1

三大组的细胞生存能力均高于80%。30 mg/mL的高浓度组是用来确认无细胞毒性。

关于NP(0.1), NP(0,8D3) 的溶血试验以及血浆蛋白结合反应，已在之前研究中证实无溶血作用和很低的血浆蛋白结合作用。

由于之前的细胞模型不能准确模拟血脑屏障，因此需要在老鼠体内做试验。

将老鼠分为8组，分别给予：

1. 试验组：NP(0.1)，NP(0.1,8D3)。
2. 对照组（不含阵痛药）：NP(0)，NP(0,8D3)，PBS和吐温80水溶液。
3. 阳性组：吗啡(具有BBB透性和明显中枢阵痛作用)，含 0.1%。 LOP的吐温80胶束溶液(表面活性剂可强化LOP在中枢神经系统的阵痛作用)。

NP(0.1,8D3)具有中枢阵痛作用。

另外，阵痛效果也通过% MPE量化：

对纳米微粒的安全性要求：注射给药：微粒大小 < 1 μm。

还未用于神经退化治疗的研究成果：PIC。

纳米微粒的物化性质依赖于它们的模板纳米乳液。

纳米乳液模型由 PBS 0.16M，吐温80，4 wt.% PLGA 乙酸乙酯溶液组成。

药物洛哌丁胺在乙酸中的溶解度很低，必须加入乙醇助溶。

和没有使用乙醇的纳米乳液模型相比，加入了乙醇的纳米乳液形成域被扩大了，可以解释为表面活性剂改变了油水两相的分配比。

由Fig1可知，由于0.1 wt.%LOP的加入，缩减了纳米乳液形成域。

含90 wt.%水相和 O/S = 70/30 的纳米乳液(表面活性剂含量为3 wt.%)被选为纳米模版，可制备较小粒径(45 nm)的纳米粒。

乳液滴变大

由于在纳米乳液的油相中加入了洛哌丁胺，使得液滴大小从45 nm增大到120 nm左右。增大LOP的含量，也同时增大了微粒大小，并不利于透过BBB。

液滴增大是由于加入了药物，并与药物浓度成正比，原因是药物的加入扰乱了纳米乳化过程。特别的，在当前研究中，加入的第二种溶剂也可能导致液滴增大。

尽管如此，这样的液滴也能满足静脉注射给药范围的需要。

纳米微粒浓缩

药物的包装效率非常高(>99 wt.%)，是因为使用了纳米乳液模板法制备，以及LOP的低水溶性。先前制备的纳米粒上LOP达不到治疗剂量。而高浓度的LOP不能被加入到油相中，因为其在油相中的溶解度有限。尽管如此，通过一个简单的浓缩步骤，然后透析，纳米粒可被浓缩到达治疗剂量而不改变其物化性质。

LOP释放

通过载药纳米粒分散体在体内，胶束，水溶液中的试验比较，结果出乎意料。

通常情况下，药物在聚合纳米粒中经过长时间会完全释放。例如洛哌丁胺在水中经过5天会完全释放。然而，在胶束溶液中，同样的时间会保留约25%的药量。同时，NP(0.1)会保留85%的洛哌丁胺。胶束中的现象可能是由于药物与表面活性剂分子之间的相互作用引起的。而NP(0.1)中的药物被聚合物强力限制释放过程。PLGA聚合物和LOP一样是疏水的，因此在疏水环境下，LOP的释放也会被限制。另外，PLGA在这段时间内不会被降解，也限制了LOP的释放。

虽然LOP和吐温80也可能发生相互作用，但被排除了。因为吐温80在色谱中的保留时间和LOP相似。LOP的低释放率和释放速度不利于体外使用。

LOP体内释放：

由于PLGA的生物降解，可强化LOP释放而在体内发挥药理作用。LOP低速持续的释放过程是一个优点，因为这样能发挥长期的药理作用。(缓释)

毒理

之前证明了，制备的纳米粒不会产生细胞毒性和溶血作用(治疗浓度)。和血液成分的相互作用也很弱。因此，这种纳米粒具有较长的血液半衰期，保证了它们能达到BBB而不破环组织和血液成分。

BBB透性

经8D3抗体表面修饰的纳米粒可强化BBB透过性，因为会和转铁蛋白受体结合。值得关注的是经8D3抗体修饰的纳米粒的大小在通过被动转运到BBB时，维持在一个范围内。

8D3修饰的纳米粒大小由SEC测定。

体内试验

通过测定NP(0)，NP(0.1)，NP(0.1, 8D3)的% MPE值，证明它们都可以透过BBB，虽然透过程度不一样。

先前的研究是通过测定阵痛作用来评价BBB透过性。

洛哌丁胺目前用于止泻，因为它本身不能透过BBB而没有中枢作用。然而，设法使洛哌丁胺透过BBB进入中枢神经系统，它就可以起到中枢阵痛作用。

由于热板实验可测量背脊神经上的疼痛反射，因此被选为一种合适的研究BBB透性的实验。

当纳米微粒被抗体修饰后，% MPE值显著上升(大约52%)，差不多和阳性组吗啡的效果(57%)相当。同时也证实了这个结果和附加的抗体有必然联系。

尽管这种纳米粒的阵痛效果不如吐温80 + LOP，但它们确实比对照组的效果高，因此也证明了它们能透过BBB。

尽管吐温80被FDA批准用于注射给药，但在胶束溶液中溶解LOP所需浓度比在纳米分散体中的要高，这是不希望看到的。

胶束溶液产生的效果会很快消退，而纳米分散体的效果可以保持。

装载有洛哌丁胺的PLGA纳米微粒(通过纳米乳液模板采用低能量法制备)能够高效率地穿过BBB到达CNS。

当含有微量的吐温80的载药纳米微粒被8D3抗体修饰后，药效更强。

O/W型纳米乳液由90 wt.%的水相和 O/S = 70/30(折中值，液滴大小满足50 nm，并且较少的表面活性剂)组成。

纳米乳液在油相中经重构，加入了0.1 wt.%的LOP，使液滴大小在100 nm左右，适宜注射给药。

和之前的研究相比，可渗透入BBB的吐温80表面活性剂是纳米微粒的一部分，这样可避免耗时耗力的包装步骤。

同时，采用简单可控的PIC方法制备纳米乳液模板，非常适合用于制药行业。